天然水蛭素的历史

●欧洲人使用水蛭素始于100多年前，当时西方人认为人体失调和发热的症状是由于血液过多引起的，因而使用日本医蛭(Hirud nipponia)放血。

●1884年，英国威尔士国家医学院的海克拉夫特(Huaycraft)博士首先发现医蛭咽部具有抗热的水溶性抗凝血物质。

●1904年，英国科学家雅各比（Jacoby）成功地把这种抗凝血有效成分分离出来，并命名为“水蛭素（Hirudin）”。

●1955年,德国的马克沃德特(Markwardt)从医蛭头部分离出水蛭素纯品，从此科学家们开始进行水蛭素基础生化和药理学的研究。

●20世纪60年代完成了水蛭素的氨基酸序列分析；70年代确定了肽链的组成和一级结构；80年代完成了二级和三级结构的分析，并对药理学特性进行了广泛研究。1986年以后国外利用基因工程技术生产了重组水蛭素；1997年重组水蛭素在德国上市。

●我国从20世纪80年代末就对重组水蛭素的研究投入了大量的人力和物力，但到目前为止，国内尚未有重组水蛭素上市。其主要原因就是可能引起出血这个难以克服的副作用，因此，重组水蛭素的开发应用受到了限制。

凝血酶抑制剂水蛭素的抗凝作用

100 多年前，首次发现水蛭素有抗凝作用，以唾液腺分泌水蛭素的蚂蟥(医用水蛭，Hirudo medicinals)作为放血途径已沿用了几个世纪。在二十世纪初发现肝素之前，蚂蟥是唯一可用的抗凝方法，但直到二十世纪50年代后期才成功地从蚂蟥 中获得水蛭素。研究表明，水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂，具有多肽结构。但医用水蛭来源有限，直接从中大量分离水蛭素供给治疗需要是不可能的。近年来，基 因工程的发展使重组水蛭素(Re- comblnant hirudin，r-水蛭素)得以出现，并应用于临床。

r-水 蛭素是继肝素后的第一个新型静脉抗凝剂。虽然肝素的效果很好，但也有缺点，例如产生耐受性，引起流血不止和血小板减少症。作为一个更直接的抗凝剂， 水蛭素对全身的动脉血栓、深部静脉血栓、心绞痛和急性心肌梗死的治疗比肝素更具优点。目前r-水蛭素正进入Ⅱ期试验，对其疗效、药散学和药代动力学进行了 初步研究。本文主要介绍天然水蛭素、 水蛭素的化学、作用机制、药代动力学、临床试验和副作用。
化 学

1 天然水蛭素
天然水蛭素是由欧洲医用水蛭产生的蛋白质，不需活化而能特异性不可逆地结合凝血酶，而使酶失活。它是不舍糖的单链多肽，分子内含3个二硫链和1个硫酸化酪 氨酸残基。其主链结构由65个氨基酸残基组成，分子量约为7000．已经发现，氨基酸顺序的变化和N-端氨基酸的改变可形成多种天然水蛭素。

2 重组水蛭素(r-水蛭素)
有限的医用水蛭，不可能批量生产天然水蛭素。DNA重组技术的进展使r-水蛭素能大量生产并用于治疗。目前，已有几家制药公司用克隆方法制备水蛭素。r- 水蛭素已通过不同的生物体系得到，它的首次合成是通过采用大肠杆菌(Escherichia coli)菌株实现的。随后又成功地建立了采用酵母菌释放系统的工艺技术。采用以上方法产生的水蛭素都是以脱磺酸的形式出现的。除了63位Try残基上脱 去SO-之外，其它与天然水蛭素一样。改变N-末端和47位的氨基酸，能产生不同的水蛭素衍生物，例如水蛭素原(hirugen)_和强水蛭素原 (hirulog)。水蛭素原是水蛭素C-端53～64位的残基构成的十肽。将nPhe-Pro-Arg-Pro-Gly附加到N-端能使水蛭素原从一个 弱竞争性抑制剂转变成强的二价抑制剂(如hirulog)。

水蛭素的抗凝作用与天然水蛭素极其相似。但是脱磺酸水蛭素和另一种r- 水蛭素变异体(在47位用Asn代替Lys)与凝血酶的亲和力低于天然水蛭素。对63 位酪氨酸的磺化残基在抗凝血酶活性中的重要性众说不一。有的认为，脱磺酸水蛭素的活性只是原来的一半，但这种观点并未彻底证实。汽巴?嘉基和 Plantorgaxl两个制药公司已在1983年申请专利，他们的r-水蛭素处于临床验证中。
作用机制

为了理 解水蛭素的作用机制，有必要弄清凝血酶在止血过程中的作用。凝血酶分为a、B、7三种类型，主要是a-凝血酶介导纤维蛋白原的凝血活性和凝血酶的其他生理 活性。尽管凝血酶在不同疾病阶段有不同功能，但它们的首要功能是保持循环系统中的血液和血管修复，这种作用包括诸如蛋白原、凝血因子V、Ⅶ 和瑚、蛋白C和S以及补体等血浆蛋白的活化。同时，凝血酶还能激活血细胞，如血小板和白细胞；以及血管组织如内皮细胞和平滑肌。

凝 血酶来源于凝血酶原，逋过几个因子的集合作用和对凝血酶原的水解断裂而形成凝血酶。其水解是通过活化因子xa实现的，而Xa则是经Va的参与并结合于活化 的血小板表面而起作用。凝血酶的产生并不像一般的酶学过程，而更象“爆发”过程，因此为持续产生凝血酶，需要因子V 的不断活化作用。

肝 素必须有内在辅助因子(抗血栓素Ⅲ、肝素辅助因子Ⅱ)才能起作用。而水蛭素则不需要辅助因子或介导酶引发其抗凝作用。水蛭素与 一凝血酶高亲和力地形成一种非共价键的1：1的复合物。水蛭素羧基端的阴离子通过离子键与凝血酶上的阴离子结合部位(ABE)连接，而另一端的碱性侧链则 结合到凝血酶的极性表面上，包围这一凝血酶的催化位点。这两种主要的相互结合解释了一凝血酶一水蛭素复合物的内部高亲和力。凝血酶一水蛭素复合物能抑制所 有凝血酶水解蛋白的功能，这种功能是凝血的关键。因此凝血系统活化后产生的少量凝血酶被抑制，这种“爆发”过程中断了，使得更多的凝血酶的产生得以终止。 虽然因子V是由因子 xa活化的，但在凝血酶的参与下会迅速完全活化。

抗凝效应的大小取决于血液中水蛭素的浓度，也就 是说，凝血参数的延长与水蛭素的浓度密切相关。天然水蛭素和r-水蛭素能完全抑制凝血酶活性和因子V的活化。然而水蛭素原只能抑制凝血酶活性却不能抑制因 子V的活化。与水蛭素不同，水蛭素原不与凝血酶的催化位点反应。相反，水蛭素原与ABE结合，抑制凝血酶的纤维蛋白原溶解作用。这样，可以在没有完全抑制 因子V活化的情况下阻止血块形成，以减少机体大出血的危险。当然，也削弱了水蛭素原的抗凝作用，这些理论都有待临床验证与水蛭素相同的是，hirulog 既能抑制ABE，又抑制凝血酶的催化部位。但催化部位的抑制是短暂的，因为一旦Hirulog与其结合，凝血酶就会慢慢地分裂其氨基端的Pro-Arg共 价键，使hirulog转变成类似水蛭素的片段，这种特性使hirulog成为凝血酶可逆性的抑制剂。

药代动力学

1 药动学参数
到目前为止，水蛭素和r-水蛭素的药代动力学参数仅在正常的自愿受试者身上确定出来，至于水蛭素原和Hirulog的药代动力学数据至今还未公布。另外， 专家们已运用了不同的水蛭素分析法来测定，其中，有些测定了凝血酶一水蛭素复合物的浓度、活性，有的运用了免疫学技术，因方法不同，药动力学数据间存在着 差异．但天然水蛭素和r-水蛭素的药动学数据并未出现重大的不同。

2 吸收
r-水蛭素吸收不完全，气管给药，r-水蛭素吸收率为30%，直肠给药未见吸收，但r-水蛭素在皮下和肌肉注射均表现出良好的吸收。

3 分布
静脉注射后，天然水蛭素和r-水蛭素很快分布各处。对普通正常自愿受试者研究所得t（1/2）在0.l5～1.24h变动。最大浓度在 0.6～1.0~-g／ml问变动。皮下或肌肉注射，分布阶段延长，最大浓度降低，表现分布容积(Vd)在8.9～l7.2 L范围内变动V和tn测定结果的差异可能是因为测定方法的不同和相互影响所致 从V的大小可以看出水蛭素分布至血管外液。在动物实验中， r-水蛭素不能越过血一脑屏障。

4 代谢和排泄
天然水蛭素和r-水蛭素对肝代谢的耐受极小。有关人的广泛药代动力学研究还未得出结论。但动物试验表明，静脉给药后1h内有70%被肾排泄，5 h后95%被排泄，并以原形从尿中排出。水蛭素在人体中的消除符合一级动力学，t（1/2）大约在0.6～2.0 h．人体试验表明，天然水蛭素和r-水蛭素的总消除速率为160~230ml／min，其中肾清除为总量的35～56%,因此，肾机能缺损的病人将会减少 水蛭素的消除，有关肾机能障碍病人的r-水蛭素的药动学研究业已进行中。

药效学

与药动学的研究类似，目前药效学的研究也仅在少数正常自愿受试者中进行。正在进行的临床试验将为水蛭素对特殊病人的药效学提供重要的信息。天然和r-水蛭素是凝血酶不可逆的抑制剂，有关它们对止血系统的作用已被证实。

水蛭素给药后，APTT、PT和TT明．显延长。凝血参数表明水蛭素作用是随时程而变化的。作用的强度含维持的时间长短与水蛭素的浓度密切相关。但这种关系在具有高水平的凝血酶活力的病人(例如那些心肌梗死或弥散性血管内凝血的病人)中还未被证实。

天然水蛭素和r-水蛭素对纤维蛋白溶懈系统和血小板数量没有太大的影响。而且，无论哪种水蛭素，以皮下或静脉注射均不会引起心率、血压或呼吸频率的改变。总之，水蛭素在正常健康自愿受试者中已被证实有良好的耐受性。

凝血酶与脑水肿的实验研究

近年来，有关脑出血后脑水肿产生机制的研究中，凝血酶成为人们最为关注的一个焦点，因此，本实验将外源性凝血酶 导入SD大鼠尾状核，建立脑水肿模型，观察不同剂量凝血酶在不同时相对脑水肿的影响以及凝血酶特异性抑制剂：水蛭素、钙离子拮抗剂能否对抗或减轻凝血酶的 这种作用。
材料与方法
一、实验动物 健康雄性Sprague—Dawley(SD) 大鼠，月龄10～12个月，体重300～400g，由苏州医学院动物实验中心提供。
二、试剂 鼠凝血酶(由sigma公司提供)；水蛭素(由sigma公司提供)；尼莫地平(尼莫通)注射液(德国拜耳公司产品)。
三、仪器动物立体定向仪(西安光学医疗器械公司)；电子天平(湘仪天平仪器厂，TZ328A)。
四、 动物分组方法 将大鼠随机分成6组。l 组：生理盐水组；2组：小剂量凝血酶(1U)组；3组：大剂量凝血酶(5U)组；4组：小剂量水蛭素(1U)与小剂量凝血酶(1U)同时注入组；5组：大 剂量水蛭素(5U)与大剂量凝血酶(5U)同时注入组；6组：尼莫地平组(在建立模型后即刻给予腹腔注射尼莫地平50t~g／100g体重，以后每天注射 1次至实验结束，共1周)。然后观察每个组在4h，24h，48h，3d，7d各个时相点上脑含水量的变化及组织病理学改变，每组每时相点各取5只大鼠。
五、 模型制备 参照Rosenberg等报道的方法，用3．6％水合氯醛腹腔麻醉大鼠(ml／100g体重)，按包新民等报道方法将其固定在立体 定位仪上，头顶正中切VI，暴露前囟，参照大鼠立体定位图谱，于坐标前囟后0．2mm，中线向右旁开4mm 处钻一直径为lmm 的／mL，用固定于立体 定位仪上的微量加样器沿针孔进针，进针深度为5．5mm(即尾状核位置)，在5分钟内将50 1生理盐水或凝血酶、水蛭素(用生理盐水稀释到50tA)等 以10~d／min的速度注入大鼠右侧尾状核，留针5分钟后缓慢退出，颅骨小孔用骨蜡封口，所有操作均在无菌下进行，皮肤切开处用庆大霉素点滴，缝合切 口，术毕将大鼠放回笼中
自由活动进食。
六、脑含水量测定(干湿重法) 动物处死后迅速提取脑作冠状全脑切片(定位切片发现注射部位 在右侧尾状核)，取含注射部位脑组织前部做脑含水量测定，后部做脑组织病理学观察。脑含水量测定采用干湿重法，称取湿重后，在ll0~C红外线干燥箱中烘 干24小时至恒重，称取干重，脑含水量(％)：(湿重一干重)／湿重X 100％。
七、病理学观察在选定的时相迅速断头取脑，沿冠状面切下厚约2mm 的脑片，置入10％甲醛中固定，常规HE染色，石蜡包埋固定切片，普通光镜下观察。
八、统计学处理所得数据以均数±标准差(±S)表示，各组间差异采用t检验，P<0．05有统计学意义。

结 果
病理组织(HE染色)结果：大剂量凝血酶组4小时出现轻度细胞水肿，血管周围间隙稍增大。大剂量凝血酶组24～48小时神经细胞水肿及细胞周围水肿均很明显。尼莫地平组24～48小时细胞水肿较大剂量凝血酶组有所减轻。
讨 论
凝 血酶是一种血清丝氨酸蛋白酶，由非活性的凝血酶原产生，催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白，并影响级联反应中几个不同的凝血步骤。自发性脑出血后，凝血酶主要 由以组织因子为始动因子的外源性凝血途径产生，一般全血可产生260～360u／m1血浆的凝血酶，而lml血液仅需1U 凝血酶就能在15秒内凝固，血 液中凝血酶的潜力比凝血所需凝血酶的数量大得多。经研究证实凝血酶符合神经毒性介质的条件，有研究认为低剂量凝血酶能保护神经元和胶质细胞免受低血糖、缺 血等损伤导致的细胞死亡，大剂量凝血酶则对脑细胞有损伤作用，Lee等报道脑实质内血肿(约54m1)产生的凝血酶(约10U)能引起血肿周边的脑组织水 肿，且认为早期脑水肿(出血后24小时内)是细胞毒作用，后期(24小时后)则是由于凝血酶造成血脑屏障的破坏。凝血酶的这种作用可被它的特异性抑制剂水 蛭素有效抑制，从天然水蛭中发现提取的水蛭素是已知的作用最强的凝血酶特异性抑制剂，它具有一个和凝血酶受体的某个区域类似的羟基尾部，与凝血酶以1：1 比例非共价键形成复合物，既阻断凝血酶的催化位点，又占据阴离子的结合位点。本实验应用鼠凝血酶注入鼠脑，诱导脑水肿模型来研究凝血酶在脑出血后脑水肿的 作用，本研究结果显示：小剂量凝血酶(1u)未产生脑水肿，大剂量凝血酶(5U)产生明显脑水肿，注射4小时后局部即可形成明显脑水肿，其高峰期在 24～48小时，3至7天开始消退并趋于正常，这一水肿变化过程与脑内注射血液形成血肿模型后脑血肿周边脑水肿变化极其相似。这一结果也提示凝血酶是脑出 血后脑水肿形成的关键因素。上述实验过程中凝血酶所致水肿作用可被水蛭素有效抑制，尼莫地平也能明显减轻脑水肿(注射4h后即能明显减轻脑水肿)。国内外 研究表明脑血肿局部存在血流量下降、钙超载，同样研究发现，给实验动物注入凝血酶后，同侧大脑半球血流量下降，也可导致神经细胞缺血缺氧，进一步可导致钙 超载，而细胞内钙超载可激起一系列连锁反应导致脑水肿，其机制可能为(1)Ca2 沉积于线粒体，干扰氧化磷酸化过程，氧化代谢异常，自由基产生过多，而 消除自由基的各类酶的活性下降，自由基不能被及时清除而产生氧化反应，促使脑水肿发生和发展。(2)细胞内Ca2 增多，干扰氧化磷酸化过程，葡萄糖的氧 化代谢紊乱，转向无氧糖酵解，产生大量乳酸，引起酸中毒，从而加重了脑水肿。(3)细胞内Ca2 超载，氧化磷酸化受干扰，ATP生成不足，Na ／K- ATP酶活性下降，Na 进入细胞内，水钠潴留，产生脑水肿。 而尼莫地平是一种选择性钙超载阻滞剂，通过阻滞钙超载而减轻凝血酶所致的实验性脑水肿。

美研究显示凝血酶抑制剂可改善早期PCI的ACS患者结果

美 国Duke临床研究中心的Peter R.Sinnaeve医生及其同事在12月的《欧洲心脏杂志》（Euro Heart J 2005；26：2354-2355，2396-2403）上报告，通过综合研究比较直接凝血酶抑制剂与肝素对近36000例患者影响的研究数据，他们发 现对于进行了早期经皮冠脉介入术（PCI）的急性冠脉综合征（ACS）患者而言，直接凝血酶抑制剂的作用优于传统肝素（unfractionated heparin）。

研究显示，直接凝血酶抑制剂的益处主要是在PCI当天有较低的心肌梗死发生率。研究者使用Cox模型并根据 早期PCI情况，评估了直接凝血酶抑制剂的独立影响。在试验中使用的直接凝血酶抑制剂包括阿加曲班、比伐卢定、依非加群、水蛭素和伊诺加群。共有7049 例患者在随机化的72小时内进行了PCI。这个亚组在30天时，接受直接凝血酶抑制剂的患者比接受肝素的患者死亡或心肌梗死的发生率显著降低了34%。而 对未进行早期PCI的患者，直接凝血酶抑制剂的作用不优于肝素。

研究者及其同事承认，虽然直接凝血酶抑制剂对进行了PCI 的患者有较大的治疗作用，但是这个作用是由于PCI本身还是直接凝血酶抑制作用的较好效果还不能确定。但相关评论的作者指出，根据这项研究，人们可以推测 最佳的抗血小板和抗凝血酶治疗可预防这些患者危急事件的进展。

天然水蛭素的化学结构和性质

水蛭素是从吸血水蛭 （如菲牛蛭Poecilobdella manillensis、日本医蛭Hirudo nipponia等）唾液腺及其所分泌的唾液中提取的一种主要有效生物活性物质。它是由65个或66个氨基酸残基组成的单链多肽,分子量为7000,不含 精氨酸,甲硫氨酸和色氨酸。水蛭素为灰色或白色小片状或粉末,易溶于水,不溶于乙醇和丙酮,水溶液显酸性。在干燥状态下稳定,在水溶液中室温可保存6个 月,加热至80℃,15分钟不被破坏。

水蛭是我国传统中药，一千八百年前《神农本草经》中就有记载，中医认为它有破血、逐 瘀、通经的疗效，主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤，西方也常用水蛭素吸血以治疗某些疾病。从水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分，水蛭素 是其中活性最显著并且研究的最多的一种成分，它是由65 一66个氨基酸组成的小分子蛋白质（多肽）。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止世界上所发现的已知物质中最强的天然凝血酶物质。动物试验与临床 研究表明，水蛭素能高效抗凝血／抗血栓形成以及防止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象，此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增 殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素由有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病 过程中抗凝血酶往往减少，这将限制肝素的疗效， 采用水蛭素会有较好的效果。

水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于 治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管内凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血 液循环和血液透吸过程，在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用，它能防 止肿瘤细胞的转移，已证明有效的肿瘤如纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病细胞等。水蛭素配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流 而增强疗效。

动物性试验和临床研究证明，静脉和皮下注射水蛭素均无明显副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、 血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50＞50mg／kg，远大于治疗所用的 剂量（lmg／kg）。此外，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶 的作用，这就可以解释为何服中药水蛙提取液仍然有疗效的原理。

由于水蛭具有重要开发价值，而水蛭来源有限，故国内外医药界均 着重研究通过基因工程取得重组水蛭素。1986年后，重组水蛭素已在大肠杆菌和胶木菌中分别表达成功。与天然水蛭素相比，重组水蛭素在 63位氨基酸上未硫酸酯化，活性略化，其性质基本相同。在治疗的剂量下静脉注射无毒副反应。现国外一些大的生物技术公司已进入多方面的临床研究。有关水蛭 素类多肽的专利，每年公布的数量至少在十多项以上，包括水蛭素类似的多肽、活性水解产物、剂型改造、生产工艺、检测方法、临床治疗的疾病等，研究论文每年 在数十篇以上。估计不久重组水蛭素类多肽药物将会正式用于临床。

近年来在我国以水蛭为主要成分的中成药已有多种，如脑血康 口服液、抗血栓片、活血通胶囊，其产值达数千万元。含水蛭的新药也在不断研究推出。利用基因工程生产重组水蛭素类多肽药物，以取代水蛭和抗凝化瘀药的添加 成分，这在近期内就可实现。作为注射剂用于心血管系统疾病和肿瘤治疗药物，则还需进一步的临床研究。毋庸置疑，重组水蛭素类多肽药物的研制将会带来巨大的 社会效益和经济效益。

三、天然水蛭素的功效

天然水蛭素是迄今为止世界上所发现的已知物质中最强的天然抗凝血酶物质,它能高效抗凝血、抗血栓形成，对人类心脑血管疾病尤其是血栓性疾病等有独特的疗效,其防治效果远比目前临床上用于治疗血栓性疾病的常用抗凝药物—肝素要好，其原因是天然水蛭素具有以下优点:
（1）天然水蛭素抑制凝血酶的反应不需要抗凝血酶Ⅱ(AT-Ⅱ)作为辅助因子,使其抗凝作用与量效关系更吻合而且可在缺乏抗凝血酶Ⅱ的病人(如弥漫性血管内凝血)中使用；
（2）肝素不能灭活结合于血栓上的凝血酶,而天然水蛭素则对循环中的和结合于血栓的凝血酶都可疑抑制；
（3）肝素会被激活的血小板释放的血小板因子4(PTF4)或富含组氨酸的糖蛋白等结合,而天然水蛭素则不受这些因素的影响；
（4）肝素用于抗血栓治疗,出血副作用较大,而天然水蛭素用于抗血栓治疗,出血副作用较小,且无过敏反应和免疫原性,无毒反应。
同时，水蛭素还可直接扩张血管，降低血液粘度，促进血液循环，加快血流速度，减少血管阻力，降低血小板凝集性；降低血脂，减少血管壁脂质的沉积，此外，还具有抗炎、抗肿瘤和免疫抑制作用。
综上所述，天然水蛭素在血管内起到一个“清道夫”的作用（即清除血液中多余的血脂、血栓等“血垢”）。